单细胞核转录组助力解析激活GPX4改善阿

摘要

阿霉素（DOX）是一种抗肿瘤药物，但是因其易诱发心脏毒性而限制了临床使用。过量亚铁离子引起的脂质过氧化被认为是DOX诱导型心脏毒性（DIC）的关键分子机制。铁螯合剂右丙亚胺（DXZ）是FDA批准的降低DIC的唯一药物，但其副作用较多，无法作为预防用药应用于临床实践。单核RNA测序（snRNA-seq）分析鉴定到DOX诱导的铁死亡易发于心肌和上皮细胞。体外实验发现谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）的活化剂硒代蛋氨酸（SeMet）可显著降低多不饱和脂肪酸（PUFAs）和氧化脂质水平。细胞和动物模型实验进一步表明，与DXZ、ferrostatin-1和生理盐水相比，SeMet显著减低了H9C2细胞DOX诱导的脂质过氧化和C57BL/6小鼠的死亡率。SeMet能够有效降低C57BL/6小鼠和乳腺癌患者心脏损伤的血清标志物水平。C57BL/6小鼠GPX4基因敲除会导致PUFA水平的增加，进而导致SeMet对DIC的保护作用的消失。SeMet在保持DOX对乳腺癌模型的抗肿瘤功效的同时，还具有避免心脏毒性的保护功能。这些研究表明GPX4的药理学激活是预防阿霉素心脏毒性的一种有价值、有前景的策略。

本研究是由华中科技大医院、医院、哈尔滨医科大医院联合完成，通讯作者为黄楚鹰博士研究生、李水洁教授、王永生教授和张涛教授。菲沙基因有幸承担了本研究的单细胞核RNA测序和分析，以及bulkRNA测序和分析工作，菲沙基因单细胞事业部毛勇和雷凌姗为本文的共同作者。

研究结果

1.单细胞测序揭示DIC的心肌细胞特征

为了阐明DOX诱导的心肌损伤机制并筛选潜在药物来预防DIC，研究者对DOX处理小鼠（DOX20mg/kg，n=3）和未处理小鼠（n=3）的心脏样本进行单细胞核转录组测序（snRNA-seq）。共鉴定到32个cluster，包含12种不同的细胞类型（图1）。其中，非免疫细胞包括心肌细胞（Ryr2,Trdn,Myh7,Myh6,Ttn），成纤维细胞（Pdgfra），内皮细胞（Pecam1,Vwf,Cdh5,Cd93,Ldb2,Tie1），脂肪细胞（Plin1,Pparg,Adam12），平滑肌细胞（Acta2,Tagln,Myh11），上皮细胞（Wt1,Tbx18,Krt18,Msln）和周皮细胞（Pdprb）等。与多数DOX诱导的心脏毒性研究一样，该研究也聚焦于心肌细胞，并鉴定到4种具有不同基因表达谱的心肌细胞亚型。

图1DOX治疗后心脏细胞的单细胞核图谱

为进一步研究化疗后心肌细胞的特征，研究者比较了两组之间的转录组图谱和通路富集。结果发现DOX治疗后肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌细胞中的肾上腺素能信号、心肌收缩、致心律失常性右室心肌病以及铁死亡等通路显著富集。进一步，对4个心肌细胞亚型的组间差异基因进行功能分析，发现CM1和CM3亚型与铁死亡关系密切。对已知的铁死亡相关基因如Gclm、Fth1、Hmox1、Slc39a14、Ftl1、Nqo1、Cp、Map1lc3b、Ncoa4表达分析，发现它们主要在心肌细胞和上皮细胞中显著上调（图2a-g）。此外，研究也对免疫细胞及其亚型进行了类似的分析。综上所述，单细胞测序鉴定到心肌细胞和上皮细胞是DOX诱导铁死亡的主要特异性细胞类型。

图2DOX铁死亡与诱导心脏毒性相关

2.SeMet通过抑制脂质过氧化改善DIC

GPX4是一种含硒蛋白质，通过抑制不饱和脂肪的过氧化作用在铁死亡的进展中起关键作用，同时硒的补充增强了GPX4的活性。鉴于铁死亡是DIC的一种潜在机制，研究者提出一种假设，即GPX4的药理学激活可以阻止DOX诱导的心肌损伤。研究测试了5种硒化合物，发现SeMet在急性DOX模型中对DIC的保护作用最高；在第14天，补充SeMet的小鼠存活率为60%，而单独使用DOX的存活率为0低剂量DOX（15mg/kg）的生存比较实验发现DIC与铁死亡相关，且SeMet的心脏保护作用优于经典的铁死亡抑制剂ferrostatin-1和DXZ。此外，SeMet还显著抑制了DOX诱导的血液中心脏生物标志物的增加。研究还发现，在H9C2细胞模型中，SeMet减少了DOX诱导的细胞死亡和脂质过氧化（图2h-m）。

为了进一步探索SeMet抑制脂质过氧化的机制，研究者检测了PUFAs脂质（过氧化反应的底物）的水平。结果显示补充SeMet可以显著降低H9C2心肌细胞中7种PUFAs的水平（图2n-q）。

DIC能够导致扩张型心肌病和心力衰竭，左室射血分数（EF）和缩短分数（FS）是评价DOX心脏毒性的最佳参数，过度的心脏纤维化是各种心脏疾病和心力衰竭进展的重要因素。因此，采用EF和FS评估DOX治疗后心脏功能，采用心脏纤维化评估DOX治疗后心肌损伤的严重程度。在DOX治疗后4周测量心脏收缩功能的另一个模型中观察到一致的心脏保护作用（图3a-d）。值得注意的是，SeMet治疗也显著阻断了DOX给药后小鼠心脏组织的纤维化（图3和f）。研究还发现SeMet治疗对线粒体功能和呼吸链复杂的细胞通路具有广泛的影响。此外，DOX处理比对照处理产生更多的JC-1单体，而SeMet的补充能够显著减弱这种DOX诱导的效应（图3h）。为了评估SeMet对DIC基因表达重编程影响，还对心脏组织进行了bulkRNA测序，差异分析发现DOX主要诱导了肌细胞凋亡过程、横纹肌细胞凋亡过程等通路基因的富集。综上所述，SeMet具有抑制DOX诱导铁死亡和缓解DOX诱导心肌疾病的潜力。

图3GPX4药理学激活保护小鼠免受DOX诱导的心脏毒性

3.SeMet的保护作用依赖于GPX4

为了探索SeMet的保护作用是否依赖于GPX4，作者构建了杂合GPX4敲除（GPX4hetko）小鼠以评估GPX4对小鼠心脏形态学、心功能和电生理的作用。与GPX4wt小鼠相比，GPX4杂合消融对心脏形态学和功能以及EF和FS的影响可以忽略不计（图4a-d）。为进一步验证SeMet是否以GPX4依赖的方式降低DOX诱导的心脏毒性，研究给予雄性野生型以及GPX4hetko小鼠单次高剂量DOX。生存分析表明相对于对照组，GPX4激活剂SeMet预处理组DOX诱导的死亡率显著降低，且这一作用依赖于GPX4的表达（图4e）。为了确定GPX4在维持小鼠心脏组织中脂质代谢内稳态中的作用，研究还进行非靶向脂质组学测定以鉴定两组小鼠心脏组织之间的差异代谢物。代谢组学分析发现野生型样本和GPX4hetko样本区分明显，表明GPX4的缺失可导致心脏脂代谢的全局变化（图4f）。脂代谢组分析发现GPX4缺失能显著减少52种PUFAs的水平（图4g-n）。与对照组相比，SeMet治疗导致H9C2心肌细胞中5种PUFAs水平显著降低（图2n-r）。综上所述，作为GPX4激活剂的SeMet调节心脏中PUAFs的水平，并在GPX4存在的情况下能够抑制DIC。

图4SeMet的保护作用依赖于GPX4

4.SeMet不影响DOX的化疗疗效

理论情况下，预防DIC的理想药物不应该损害DOX的抗肿瘤疗效。为了进一步探索在DOX治疗期间SeMet作为护心剂的作用，研究评估SeMet和DOX对肿瘤生长的联合作用。在4T1乳腺癌细胞模型中，SeMet和DOX组合呈现出体外良好的抗肿瘤作用（图5a）。SeMet不会减弱DOX和顺铂的抗癌效率，采用SeMet和DOX组合疗法能够达到比仅单独使用SeMet或DOX更好的抗癌效果（图5b）。

图5SeMet增强DOX抗肿瘤活性

5.SeMet降低乳腺癌患者心肌酶

SeMet还未被FDA或CFDA批准用于临床使用。为了进一步探索SeMet作为临床药物的潜力，研究采用了富硒（Se）平菇（主要形式为SeMet）作为硒来源，首先评估了不同浓度的富Se平菇，以鉴定符合有效剂量范围以防御DIC。与上述研究结果一致，平菇中1.5mg/kgSeMet展示出最高程度的保护作用（图5c）。以富硒平菇片和平菇片作为安慰剂进行探索性临床实验（ChiCTR），结果发现富硒平菇能显著降低心肌损伤中血清标志物，包括CK-MB和MYO（图6c）。并且与本项目之前的研究一致，Se的补充能够减少化疗后血小板和血红蛋白的下降（图6d）。作者同时研究了DOX治疗后过氧化脂质类的变化，靶向代谢分析发现在第2次AC治疗方案之后富硒Se平菇片降低12-HEPE、14-HDHA、13-HODE水平，但在安慰剂和Se补充剂分组之间没有显著差异（图6b）。

图6SeMet降低乳腺癌患者心肌酶

总结

本研究发现SeMet以一种GPX4依赖的方式抑制DOX诱导的铁死亡，且不影响化疗效果，表明激活GPX4可能是一种有效预防DIC的策略。本研究采用单细胞RNA和bulkRNA测序，为从细胞类型水平揭示DOX诱导的心肌损伤机制提供了重要的细胞和分子靶标。此外，大量的体外、细胞和动物模式实验更为证明SeMet的疗效提供了详实的证据。

参考文献

[1].CHuang,YGuo,TLi,et.al.PharmacologicalactivationofGPX4amelioratesdoxorubicin-inducedcardiomyopathy.RedoxBiology.,.

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