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长和生物脐带源间充质干细胞的临床应用
间充质干细胞（MSCs）移植被认为是细胞治疗的最有效方法，其由多种机制同时作用，影响整个受损组织再生阶段。骨髓源间充质干细胞（BM-MSCs）因具有较全面的干细胞特性，是公认具有“黄金标准”的干细胞。随着科研工作的展开，越来越多的学者把目光投向其他来源的间充质干细胞，脂肪、外周血、脐血、羊水、皮肤、牙髓、滑膜、脐带胎盘组织、子宫内膜等，事实上，MSCs可能存在于身体任何含血管的组织中。所有这些细胞都符合MSCs的界定标准，但他们的特性有显著的差异。脐带源间充质干细胞(UC-MSCs)因其同时具有产前和产后的干细胞的特性，近年来逐渐成为干细胞研究的重点对象。
1.脐带的起源及形态
脐带作为胎儿与胎盘之间连接的导管，是由羊膜包卷着卵黄囊和尿膜的柄状部分伸长而形成。脐带基质包含的胶状物质称为华通氏胶。华通氏胶提供了脐带的柔韧性，同时保护脐带血管（两条脐动脉和一条脐静脉）不互相缠绕。华通氏胶是由大量的葡萄糖胺聚糖（主要是透明质酸和硫酸软骨素）构成，主要的纤维成分为胶原纤维。细胞构成为间充质源细胞（成纤维细胞、肌成纤维细胞，平滑肌细胞和间充质干细胞）。与身体的大多数组织不同，华通氏胶里没有毛细血管。这是因为脐带形成初期造血过程活跃，在第6周时，开始在脐带基质中形成毛细血管，然而，在第7-9周时，造血停止，毛细血管退化。
下图为脐带横截面
2.UC-MSCs
年，脐带血成为造血干细胞和祖细胞的来源，剩下的脐带组织被认为是没有科研价值医疗废物。直到年，McElreavey等人从华通氏胶中分离出成纤维样细胞，这一观点才发生改变。年，这些成纤维样细胞被证明是MSCs。
国际细胞治疗协会(ISCT)认定，MSCs必须满足以下条件：
（1）在标准培养条件，MSCs必须贴壁；
（2）MSCs必须表达CD、CD73、CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、以及HLA-DR表面分子；
（3）MSCs在体外培养必须能分化为成骨细胞，成脂细胞和成软骨细胞。
3.UC-MSCs的分离
酶消化法一般包括以下步骤：（1）去除上皮，血管和血管周围组织；（2）机械粉碎，用胰蛋白酶，I、II或IV型胶原酶，中性蛋白酶，蛋白酶，和透明质酸酶消化；（3）置入培养基中（标准培养基中包含人或胎牛血清，可能含有生长因子FGFb、EGF、PDGF和VEGF）培养。
此外，还可以应用外植体培养法，这就避免了酶对细胞的破坏，且减少了处理时间。常用的外植体培养UC-MSCs方法是，将脐带切成小块直接贴于培养皿底部。这种方法的问题之一是，脐带块容易从培养皿底部漂起，从而减少获得的细胞数量。因此，有些方法会利用不锈钢网防止组织块漂浮。
最近的一项研究中，对比了三种外植体培养法和三种酶消化法。结果发现，外植体培养10mm大小的组织块，原代培养时间更短，分离细胞数量更多，细胞增殖率更高。免疫表型和多向分化能力在六种培养方法间无显著差异。同时发现，外植体培养法分离的UC-MSCs，更快到达生长停滞期，但这种作用机制尚不清楚。随后的研究表明，外植体培养法与酶消化法获得的细胞表现出了相似的细胞特性（形态、倍增时间、生存率、分化能力、表型）。
数据显示，UC-MSCs比其他来源的MSCs获取更为方便：
原代细胞的分离率，华通氏胶达到%，而脐血为不足60%，羊膜为90%，胎盘为62.5%-%。MSCs的获得量，华通氏胶的为10,-4,,/厘米脐带，骨髓为1-,/毫升,脂肪组织为4,-1,,/毫升。
4.UC-MSCs的增殖潜能和核型稳定性
UC-MSCs比BM-MSCs及其他来源（脂肪组织，胎盘，羊膜）的MSCs拥有更高的增殖潜能。通过有限稀释法分析CFU-F频率，UC-MSCs（1：±0.18）明显高于BM-MSCs（1：35±0.01）。另一项研究显示，BM-MSCs的CFU-F频率为0.%-0.01%，而UC-MSCs达到了0.2%-1.8%。
几项不同的研究显示，UC-MSCs细胞的倍增时间不同，分别为21小时，24小时，40小时和45小时。不同个体的UC-MSCs表现出了不同的倍增速率，且在到达衰老期时的细胞代次不同，这与细胞的遗传及表观遗传相关，与分离方法无关。
当UC-MSCs端粒酶活性较高时，一根大约40克重的脐带，传代6次可获得约细胞。从第7代开始，UC-MSCs端粒酶活性明显变弱；但是细胞核型可以稳定保持至少25代。
5.UC-MSCs的多向分化潜能
UC-MSCs在体外表现出非常高的分化能力：这些细胞能够分化为成软骨细胞，成脂细胞，成骨细胞，成牙本质样细胞，真皮成纤维细胞，平滑肌细胞，骨骼肌细胞，心肌细胞，肝样细胞，胰岛素产生细胞，胰高血糖素产生细胞，生长抑素产生细胞，汗腺细胞，内皮细胞，神经胶质细胞（少突胶质细胞）和多巴胺能神经元。年，有研究发现，在特定条件下，UC-MSCs表达男性生殖样细胞和原始样生殖细胞标记。这种分化潜能以前只在胚胎干细胞(ESCs)及诱导多能干细胞出现过。
大量的研究证明了基因修饰后（转导或转染）UC-MSCs分化的可能性。UC-MSCs过表达肝细胞生长因子（HGF），可以分化成多巴胺能神经元样细胞，分泌多巴胺、酪氨酸羟化酶和多巴胺转运体。将UC-MSCs移植进入胶原酶诱导的大脑内出血的大鼠一周后，UC-MSCs分化后能促进神经纤维的髓鞘和轴突再生。在包含SF-1cDNA的腺病毒感染后，UC-MSCs分化后显著提高所有合成类固醇激素mRNAs（包括P侧链裂解酶，3β-HSD，3型17β-HSD，LH-R，ACTH-R，Pc21和CYP17）的表达，显著分泌更多的类固醇激素（包括睾酮和皮质醇），且细胞活力显著高于分化后的BM-MSCs。
有趣的是，UC-MSCs的可塑性可能取决于妊娠状态。来自先兆子痫患者的UC-MSCs更致力于向神经胶质细胞分化：与同年龄的对照组相比，先兆子痫患者细胞中神经元（MAP-2）和少突胶质细胞（MBP）的蛋白表达标记显著增加。与足月分娩相比，早产对于UC-MSCs向神经元分化没有影响，但是向成骨细胞分化潜能降低。与正常妊娠期女性相比，妊娠期糖尿病患者的UC-MSCs表达CD、CD90、CD73的水平相似，但细胞生长减少，且向成骨细胞和成脂细胞分化潜能显著降低，此外，还表现出较低的线粒体活性，以及线粒体功能调节基因ND2，ND9，COX1，PGC-1α，TFAM的表达显著降低。因此，产妇在妊娠期代谢异常对于新生儿MSCs的生物学特性有显著影响，这种情况应当在选取UC-MSCs时考虑到。
6.UC-MSCs的分泌物
MSCs能生成多种生物活性物质，保证旁分泌机制正常运行，从而维持细胞的的治疗活性。然而,UC-MSCs的分泌物明显不同于其他来源（骨髓和脂肪组织）的MSCs。最明显的差异是几乎完全不合成主要的促血管生成因子VEGF-A，其分泌量是AT-MSCs的1/，BM-MSCs的1/0。但是，VEGF基因的转录是正常发生的，根据一些报道，与BM-MSCs相差无几。UC-MSCs的其他一些促血管生成因子（包括血管生成素和PLGF）也生成量较少，而一些抗血管生成因子（包括凝血酶敏感蛋白-2和内皮抑素）比AT-MSCs和BM-MSCs的生成量更多。反之，UC-MSCs高分泌促血管生成因子CXCL1、CXCL、CXCL5、CXCL6、CXCL8等，以及血管生长因子HGF,bFGF,VEGF-D,PDGF-AA,TGF-β2,G-CSF等。因此，UC-MSCs不通过VEGF-A实现促血管生成。
还有报道称，UC-MSCs高分泌神经营养因子，如bFGF、神经生长因子（NGF）、神经营养素3（NT3）、神经营养素4（NT4）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等，其分泌量高于AT-MSCs和BM-MSCs。
此外，对于许多重要的细胞因子和造血生长因子，包括G-CSF、GM-CSF、LIF、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-11，UC-MSCs的分泌量明显高于BM-MSCs，因此更有利于造血干细胞的扩增。
7.UC-MSCs的免疫调节性
年Weiss等人第一次探讨UC-MSCs的免疫调节特性。在体外实验得到了五个主要结论：
（1）UC-MSCs可以抑制刀豆球蛋白A诱导的大鼠的脾细胞增殖（异种移植模型）；也可以活化人外周血单核细胞（异体模型）。
（2）UC-MSCs没有刺激异种或异体免疫细胞的增殖。
（3）UC-MSCs产生的人类白细胞抗原HLA-G6抑制了NK细胞的杀伤活性。
（4）UC-MSCs不表达免疫应答相关的参与T淋巴细胞活化的表面抗原CD40，CD80和CD86。
（5）UC-MSCs产生抗炎性细胞因子具有免疫调节性。
目前认为，UC-MSCs的免疫调节活性通过旁分泌机制提供。例如，UC-MSCs产生IL-6使树突状细胞获得耐受性表型，前列腺素E2（PGE2）抑制NK细胞的细胞毒性及CD4+和CD8+T细胞的增殖，吲哚胺2,3-二氧化酶（IDO）抑制循环滤泡辅助性T细胞的分化。与BMMSCs和AT-MSCs不同,UC-MSCs分泌抗炎细胞因子IFN-α。暴露在促炎细胞因子IL-1β48小时后，相比于骨髓或胎盘源MSCs，UC-MSCs表现出免疫调节分子TGFβ1，IDO，TNF刺激基因6(TSG-6)和PGE2表达升高。活性MSCs分泌的PGE2，使原有的巨噬细胞由M1促炎表型向M2抗炎表型转化，同时TSG-6与CD44相互作用使巨噬细胞降低TLR2/NF-kB信号，从而减少炎性的促炎介质分泌。这些发现把MSCs（尤其是UC-MSCs）放在了炎症早期调节的中心位置。
有趣的是，培养条件可能会影响UC-MSCs的免疫调节特性：UC-MSCs介导的异体混合淋巴细胞反应中T细胞增殖的抑制，在无异源（含GMP认证的人源血清），无血清介质比在含标准胎牛血清介质培养中更为有效。因此，去除培养基中的异种成分，对于未来再生医学和移植医学的临床实验设计非常重要。
8.UC-MSCs与受损细胞间的线粒体转移
大约十年前意外发现，MSCs可以通过转移线粒体或生成的线粒体DNA，拯救线粒体功能丧失的细胞。这个发现对于MSCs的治疗潜能有着深远的影响，因为许多疾病开始于线粒体不足，特别是组织的缺血再灌注。
在最近的一项研究中，UC-MSCs表现出向线粒体DNA-(mtDNA-)废弃的细胞转移自己的线粒体的功能。这些幸存的细胞拥有与UC-MSCs完全相同的mtDNA，但细胞标记的表达仍然不变。更重要的是，这些细胞恢复了mtDNA编码蛋白质的表达，及新陈代谢。此外，UC-MSCs的线粒体转以后，一些细胞行为得到恢复，包括自由增殖，有氧生存力，和依赖氧化磷酸化的细胞活动。UC-MSCs线粒体转移的治疗效果可以保持至少45代。
线粒体的转移使得UC-MSCs治疗缺血性损伤或与线粒体功能障碍有关的疾病成为可能。
9.UC-MSCs的致瘤性
围产期干细胞兼具胚胎干细胞和成熟干细胞的特点，UC-MSCs多能性标记的表达高于BM-MSCs，但低于ESCs。也许这解释了UC-MSCs和ESCs之间关键的区别：UC-MSCs不诱导肿瘤发生。使用免疫缺陷的小鼠模型，对比UC-MSCs和人类ESCs的致瘤性。接受人类ESCs的小鼠6周生成畸胎瘤（皮下注射85%；肌肉注射75%；腹腔注射%），接受人类UC-MSCs的小鼠实验期内（20周）没有形成肿瘤，注射部位无炎症反应。
细胞体外转化培养模型（细胞生长在存在乳腺癌和卵巢癌细胞的培养基中30天）表明，UC-MSCs的形态、增殖率、转录组都没有发生改变，而BM-MSCs转化成肿瘤相关的成纤维细胞。
因此，在正常条件下，人类UC-MSCs可安全用于细胞治疗。
10.UC-MSCs的临床前应用研究
使用UC-MSCs在动物模型上治疗不同疾病的一些研究结果令人兴奋，包括肺损伤修复，肝切除再生，下肢缺血改善，糖尿病治疗，皮肤再生，心肌梗死治疗，放射性脊髓炎改善，结肠炎治疗，关节炎治疗，脑出血治疗等。
MSCs治疗受损组织的早期报告表明，注射的MSCs可以存活，移植，并分化为特定类型的细胞修复损伤的组织。然而，随后的研究显示，UC-MSCs移植入受体动物宿主器官的水平在全身给药后较低，而在局部给药后较高。几乎没有证据表明，UC-MSCs分化为相关细胞；这可能与异种移植有关。目前提出的关于UC-MSCs治疗活性的机制包括免疫系统细胞的营养和旁分泌作用，重塑细胞外基质，细胞凋亡，血管生成，刺激本体祖细胞迁移和增殖。所有关于UC-MSCs的临床前应用研究，都展现出了令人期待的前景。
11.UC-MSCs的临床应用研究
目前，有很多在FDA注册的临床试验（1-3期），研究未修饰的异体UC-MSCs移植治疗重大疾病的安全性和有效性。根据官方数据统计，UC-MSCs已被用于治疗急性心肌梗死，心肌病，重症肢体缺血，婴幼儿支气管肺发育不良，HIV感染，I型和II型糖尿病，急性和慢性肝脏疾病，自身免疫性肝炎，多种病因的肝硬化，溃疡性结肠炎，重型再生障碍性贫血，阿尔茨海默病，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，骨髓增生异常综合征，遗传性共济失调，脊髓损伤，强直性脊柱炎，骨性关节炎，多发性硬化，Duchenne型肌营养不良症，急性移植物抗宿主反应等疾病。
UC-MSCs临床试验的结果是令人鼓舞的，特别是在用于治疗自身免疫性疾病和内分泌疾病方面。在所有的临床研究中，除了几起发烧事件外，UC-MSCs给药治疗没有任何副作用。
目前的临床研究只开展了UC-MSCs异体移植研究。这是因为UC-MSCs存储几年前刚刚开始，所以不太可能出现自体移植患者。然而，有证据表明，MSCs自体和异体移植的疗效是相当的。
人类脐带是MSCs的来源之一，并具有以下特点：
（1）唯一同时具有出生前和出生后MSCs的特性；
（2）获取时不存在伦理问题；
（3）显著的增殖和分化潜能；
（4）无致瘤性；
（5）染色体核型稳定性；
（6）高免疫调节活性。
